基于网络药理学研究吴茱萸治疗结直肠癌作用机制

天津市人民医院   徐 靖

    方法：通过基于中药系统药理学 数据库（TCMSP）、GeneCards 数据库查找吴茱萸活性成分，作用靶点及结直肠癌相关靶点，利用 R 语言 (R 3.6.3) 分析吴 茱萸治疗结直肠癌的潜在作用靶点，并对关键靶点进行蛋白互作网络（PPI）分析以及基因本体（GO）和信息通路（KEGG） 富集分析。结果：网络药理学研究获得吴茱萸治疗结直肠癌的潜在靶点 162 个。生物信息学分析吴茱萸通过 PI3K-Akt， AGE-RAGE，MAPK，癌症中的蛋白多糖，细胞衰老，TNF，松弛素，细胞凋亡，HIF-1，雌激素，铂类耐药，EGFR 酪氨 酸激酶抑制剂抵抗，P53 等信号通路发挥抗结直肠癌作用。结论：吴茱萸通过多靶点、多通路治疗结直肠癌，为吴茱萸的分子机制研究及临床应用提供了依据。

 1 材料与方法 1.1 吴茱萸活性成分筛选及活性成分靶点获取 基于中药系统药理学数据库（TCMSP）数据 库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[15]，检索吴茱萸的活性成分；设定口服利用度 (OB）≥ 30%和类药性（DL）≥ 0.18 进行筛选。进一步应用TCMSP 数据库筛选吴茱萸活性成分的作用靶点，基于 UniProt 数据库（http://www.uniprot.org/）[16] 对作用靶点进行校正注释，整理并去重后得到活性成分对应靶点。 1.2 吴茱萸抗结直肠癌潜在靶点预测 通过GeneCards 数据库（https://www.genecards. org/）[17] 获得结直肠癌相关疾病靶点。对结直肠癌相关疾病靶点与吴茱萸主要活性成分作用靶点取交集，应用 R 语言（R 3.6.3，软件包 ggplot2）绘制韦恩图。 1.3 构建吴茱萸抗结直肠癌蛋白互作网络 将筛选得到的结直肠癌相关疾病靶点与吴茱萸主要活性成分潜在作用靶点的交集靶点导入 STRING 数据库（https://string-db.org）[18]，物种设定为“Homo sapiens”，置信度设置为 0.9，对作用靶点进行蛋白互作分析。使用 Cytoscape 3.8.0 软件进行 PPI 网络绘制，使用 Cytoscape 3.8.0 软件网络拓扑分析插件 cytoNCA 分析各网络节点的度值 (degree)、介度中心性 (betweenness centrality，BC)、接近中心性 (closeness centrality，CC) 指标。 1.4 吴茱萸抗结直肠癌靶点生物功能分析及通路分析 差异靶点富集分析，包括基因本体 （gene ontology，GO） 富 集 和 信 号 通 路（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 富集。GO 富集分析可以了解差异基因的分子功能（molecular function，MF）、 参 与 的 生 物 过 程(biological process，BP) 及细胞中的定位（cellular component，CC）。 应 用 R 语 言（R3.6.3，软件包 clusterProfifiler）[19] 对预测靶点进行 GO 分析和 KEGG 信号通路富集分析，应用 R 语言（R 3.6.3，软件包 ggplot2）进行可视化绘图

2 结果 2.1 吴茱萸活性成分筛选以及靶点的筛选 通过 TCMSP 数据库检索吴茱萸的活性成分，设定OB ≥ 30% 和 DL ≥ 0.18 筛选，获得化合物 30 个，包括吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸卡品碱、吴茱萸酰胺、棉花皮素、番石榴苷、小檗碱、槲皮素、异鼠李亭、谷甾醇、β- 谷甾醇等。进一步应用 TCMSP 数据库获得活性成分对应的作用靶点，整理去重后得到活性成分对应靶点 198 个。2.2  吴 茱 萸 抗 结 直 肠 癌 靶 点 的 筛 选  通 过 GeneCards 数据库获得结直肠癌相关的靶点 8599 个。对结直肠癌相关疾病靶点与吴茱萸活性成分作用靶点取交集获得吴茱萸治疗结直肠癌潜在靶点162 个，应用 R 语言（R 3.6.3，软件包 ggplot2）

3 讨论 中医认为恶性肿瘤是由于身体内部阴阳失衡所引起，环境、禀赋、七情、饮食起居等原因导 致体内“正气”亏虚，“邪气”聚集，发生癌变。结直肠癌的发生、发展及转归过程是正邪相争的结果。当“邪气”强盛于“正气”，疾病进展，患者即出现临床症状。中药抑制肿瘤进展的作用包括：抑制肿瘤细胞增殖侵袭，诱导肿瘤细胞凋亡，提高和恢复机体免疫功能，增强化疗药物疗效，逆转细胞株耐药等。Lai 等 [20] 研究发现，龙葵提取物可通过降低 MCF-7 抑制肿瘤细胞增殖，并上调 Caspase-3 诱导乳腺癌细胞凋亡。三叶草提取物抑制肺癌细胞 A549 侵袭转移是通过下调 MMP-2、MMP-9 表达及上调 TIMP-2 表达 [21]。消癌平注射液通过降低乳腺癌细胞中 ATF-3 的表达，促进肿瘤细胞凋亡、抑制细胞迁移和侵袭 [22]。梁颖等 [23]研究了益脾活血方促进肝癌术后免疫功能的恢复，通过降低 B7-H1 表达，消减对 T 淋巴细胞活化的抑制，纠正负性免疫调节。小檗碱与顺铂联合应用逆转胃癌的多药耐药，其机制是通过下调 P-gp、MRP 蛋白表达，并上调 caspase 家族蛋白表达，诱 导癌细胞凋亡 [24]。课题组利用网络药理学分析及生物信息学分析预测吴茱萸对结直肠 癌起作用的潜在靶点及信号通路，发现吴茱萸抗结直肠癌核心靶点包括 AKT1、TP53、MAPK1、 JUN、HSP90AA1、RELA、TNF、EGFR、ESR1、MYC 等。主要涉及通路包括 PI3K-Akt 信号通路，AGE-RAGE 信号通路，MAPK 信号通路，癌症中的蛋白多糖，细胞衰老，TNF 信号通路，松弛素信号通路，细胞凋亡，HIF-1 信号通路，雌激素信号通路，铂类耐药，EGFR 酪氨酸激酶抑制剂抵抗，P53 信号通路等。这些核心靶点及关键通路的研究有待于后续实验进一步验证。吴茱萸抗瘤谱广且高效低毒，其抗肿瘤活性的研究已取得了部分成果，然而目前临床应用仍不多。更进一步的表型及机制研究将为临床用药提供支持，期望将来吴茱萸作为结直肠癌辅助治疗的天然抗癌新药应用于临床，提高患者生活质量及生存期。

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