【干细胞】干细胞技术在急诊创伤中的潜在应用

来自奥地利国际休克协会联合会主席Soheyl Bahrami教授带来的关于“干细胞技术在急诊创伤中的潜在应用”报道让人耳目一新。

什么是干细胞？干细胞在急诊创伤治疗中到底扮演一个什么样的角色？下面就让我们带着这些问题进行深入的科学探索。

在现代发达的创伤救治系统中，及时的院前急救措施、快速的院内诊断以及基于大数据的个体化创伤病员复苏管理，使得创伤病人的死亡率和致残率得到了有效的控制，但是机体组织损伤后的恢复水平仍然与病人内在的生物学和再生能力有关。受损后机体的生理功能有时候是无法治愈的，甚至会以大量的疤痕组织增生、创伤相关性免疫系统功能障碍等形式导致伤后多器官功能衰竭。创伤后最完美的治疗就是能恢复到损伤前的功能状态而不是形成严重瘢痕组织限制机体功能。目前的研究主要集中在如何调节病人体内的生理学来优化愈合的过程。干细胞治疗是实现这一目标的一个潜在的途径。

干细胞是一种多功能细胞，能够再生人体的各种组织，因此在创伤治疗中有一定的临床潜力，特别是在骨折愈合、软骨愈合及创伤后炎症等方面。迄今为止，研究主要集中在了解干细胞的行为和功能，虽然有些转化的应用已经达到了1期临床试验，但在干细胞治疗真正达到临床实践之前，还有许多问题等待解决。

1.干细胞的生物学

身体里的再生细胞可以根据能力来进行分类，其中再生能力最强是全能型的胚泡细胞，然后是多功能干细胞、祖细胞和前体细胞（如下图所示），这些细胞具有内在的再生能力，当然这里面也有与创伤相关的特殊干细胞。干细胞是未分化的细胞，从三个原始生殖层（内胚层、中胚层和外胚层）发展而来，具有自我更新和分化为各类成熟细胞的能力。干细胞是在全身的某个局部微环境中被发现的，在这个环境中干细胞处于未分化的休眠状态。在干细胞和邻近细胞之间存在多种分子机制控制着其分化和自我保护。这里主要介绍与创伤修复相关性的4种细胞：间质干细胞（MSC），造血干细胞（HSC），脂肪干细胞（ADSC）和内皮祖细胞（EPC）。其中MSC和HSC大部分主要存在于骨髓内，EPC位于内皮细胞，而ADSC存储于脂肪组织。值得注意的是，目前有新技术可以将收获的体细胞转化为诱导多能干细胞（iPSC）并获得潜在的再生能力。

间质干细胞（MSC）是一种多功能的干细胞，可以在中胚层内分化成任何非造血细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和骨髓细胞。它们的特征是细胞表面携带标志物CD105、CD73和CD90。MSC可以在多个部位采集，包括肌肉、脂肪组织、骨髓和自体脐带中，现有技术可以在体外进行筛选、培养和增殖以供在机体移植时使用。MSC是临床试验中研究最多的一类干细胞，骨髓间质干细胞由于缺乏MHC II类分子和协同刺激分子使得它们免疫原性削弱，与多功能胚胎干细胞相比它们也不会导致畸胎瘤的形成，这些性质使得它们在自体和异体的临床应用中更有吸引力。

造血干细胞（HSC）能够分化成为粒细胞或淋巴细胞，这些细胞的特征是表面携带标志物CD34、CD45、CD133和Thy1，它们能从骨髓及外周血中获得，可在恶性肿瘤如白血病细胞、淋巴瘤和骨髓衰竭等同种异体移植中应用。

脂肪干细胞（ADSC）由脂肪组织中获得，与骨髓来源的间质干细胞功能相似，这些细胞的特征是表面携带标志物CD90、CD73和CD44。

内皮祖细胞（EPC）具有血管生成的潜力，它们存在于外周循环中，表面携带标志物CD34，Flk-1和Tie-2。

2.创伤对干细胞的影响

创伤导致组织结构性破坏，使组织灌注受损，并诱发炎症反应。干细胞对创伤的生理反应包括从它们的休眠状态中苏醒，从它们的原始居住场所中动员并向受伤的部位迁移，最后分化产生治疗所需的特定细胞。此外，病理性的炎性反应不仅会导致干细胞的功能失调，同时会使干细胞的数量减少，最终将导致组织再生失败或其他不良预后。

在创伤后MSC与HSC的迁移已被许多趋化作用阐明。其中一种信号途径就是下图所示的基质衍生因子1/特异性趋化因子受体4（SDF-1/CXCR4）轴。这条信号轴解释了干细胞在局部停留及向受伤部位迁移的过程。CXCR4是骨髓间质干细胞的一种受体，它能结合SDF-1。SDF-1是一种由骨髓内皮细胞和基质细胞表达的蛋白质，继受伤后，SDF-1在组织损伤的部位产生，其浓度高于骨髓，从而促进骨髓中MSC向受伤部位转移。SDF-1的表达受缺氧诱导因子-1（HIF-1）和一氧化氮（NO）调控。在正常生理情况下，骨髓中的SDF-1浓度有利于保留骨髓间质干细胞。这在动物骨折和心肌损伤模型中已被证实， CXCR4 受体的上调也使得间质干细胞向SDF-1迁移得到进一步加强。

3.干细胞在骨折愈合中的作用

骨在骨折后能够再生和重建。AO基金会（(Arbeitsgemeinschaft für Osteosynthesefragen Foundation）总结了骨折治疗的4个基本原则:骨折复位、骨折固定、血供的保护和早期安全的活动。基于这些原则的影响，在骨折后对血供的保护及术后早期的活动已经被证明对干细胞生物学有一定的影响。血供对干细胞迁移到损伤部位来说非常重要，而在受伤后的早期活动则提供了一种促进MSC分化的机械刺激。

骨折会引起骨髓内MSC的增生，骨折后会引起在骨髓和骨膜内的常驻干细胞迁移至损伤部位。在骨折部位需要有一定数量的干细胞进行修复，同时骨萎缩也被证实与骨折部位缺乏MSC有关。

充足的血供是干细胞迁移并存活的必要条件。Atesok, K等发现在小鼠骨折后进行纯化的EPC注射，有利于血管增生及更快的骨折愈合：在骨折部位EPC的血管生成效应与增加的亲血管生成因子hVEGF、hFGF2和hHGF 44的局部水平相关；同时还发现MSC的迁移与增加的小鼠骨痂体积和强度有关联。MSC约在EPC使用后第14天出现在骨折部位。这些治疗效果与MSC迁移后局部BMP-21（骨形态生成蛋白）的表达有关。

干细胞已被证明能对机械刺激产生反应。体外研究已经证实了干细胞对以下刺激有反应，如牵拉、压迫、剪切、震荡、超声波等。在拉伸、压迫和超声波等刺激下，干细胞可表现出成骨分化。相反地，Dai等人发现，对小鼠的MSC进行反重力作用的试验可抑制其成骨分化。有研究表明在体外试验时，低强度脉冲超声波可促进MSC的成骨转化。

4.干细胞在软骨愈合中的作用

干细胞的功能与关节软骨损伤的恢复以及创伤后骨关节炎有关。在损伤的发生后，关节软骨中的MSC会分化成纤维细胞，而不是软骨细胞。这一过程的部分原因是ADAMTS5蛋白质介导的 TGFβ-1传导途径。ADAMTS5是一种软骨聚蛋白多糖酶，创伤能诱导成纤维细胞内的ADAMTS5合成增加。而ADAMTS5能促使MSC分化成纤维细胞，而不是软骨细胞。研究发现与对照组相比，在ADAMTS5蛋白移除的小鼠中，创伤时关节组织纤维化的情况更少，由此表明创伤可引起干细胞分化的变化，并与创伤后骨性关节炎息息相关。

通过干细胞在关节内注射能改善创伤引起的软骨缺损。研究发现在小鼠模型中进行皮下注射干细胞对软骨愈合没有影响。liu等人已经开发出一种不同的治疗软骨缺损的方法：通过在骨关节炎患者身上产生的软骨组织移植来治疗软骨缺损：使用TGF-β3 和 BMP-6进行干细胞培养，在6周后利用直径超过2厘米的软骨进行移植。Saw等在50名软骨损伤的病人中进行了一项临床试验：50名患者随机分组，治疗组接受来自血液或透明质酸的自体干细胞，对照组仅接受透明质酸治疗。每一位病人都行关节镜下的软骨钻孔及软骨成形术，然后进行为期5周的膝关节注射并在第18个月行关节镜检查活检。组织学分析及核磁共振检查显示，与对照组相比，治疗组干细胞的软骨再生能力有所提高，但是关节功能评分并无差别。Oroszco等使用骨髓内分离的MSC来治疗50名膝骨关节炎患者，结果发现疼痛和功能评分得到了显著改善。Vangsness等人研究了关节镜下半月板切除术后的关节内注射MSC的效果，结果发现半月板组织再生增加，伴有骨关节炎患者的疼痛评分得到改善，且在随后的两年随访中没有出现严重的不良反应。

由此可见，使用MSC的治疗方法有望能够改善骨关节炎和创伤后的软骨缺损。目前研究的重点是确定最佳的MSC来源、如何在植入前进行体外改造及更安全地使用。关于骨关节炎治疗的已有多篇文献得出肯定的结论，只不过在临床应用前仍需要进行更多的研究。虽然MSC在骨关节炎和创伤后关节炎的治疗目的都是重新生成透明软骨，但这两种病理的微环境各不相同，目前还不清楚对于骨关节炎的治疗方法是否也同样能有效地治疗创伤后关节炎。

5. 干细胞在外伤后炎症反应中的影响及在多脏器功能衰竭中的应用

损伤后的多脏器功能不全一直被认为是由对创伤的过度炎症反应所引起。干细胞具有免疫调节功能，MSC可以转化为促炎症和抗炎细胞，它主要依赖于在创伤后炎症反应中分泌的介质如Toll样受体(TLR)。TLR是一种表面受体，它能结合病原体分子和损伤相关模式分子 (一类由创伤后细胞破坏释放的内源性产物，包括线粒体DNA(mtDNA)，高机动性的编组框-1蛋白质和S100蛋白质等，具有激活免疫细胞的能力)，在调控炎症反应中起着重要的作用。

创伤后引起的中性粒细胞和巨噬细胞激活会对干细胞造成损伤。在机体受伤后，中性粒细胞和干细胞一起迁移到受伤的部位，但它们迁移到创伤部位的时间点不同。中性粒细胞被激活后会释放活性氧，无意中损害了周围的细胞包括干细胞。如果损伤足够严重，中性粒细胞的激活状态持续存在(尤其是在细胞凋亡之后)，那么干细胞就可能会被破坏。动物实验中发现，在脑损伤小鼠模型的急性炎症反应期内，活化的巨噬细胞直接吞噬了外源性干细胞。此外，Molcanyi等人也证实，创伤引发了巨噬细胞的激活，而非那些具有免疫活性的干细胞。

严重的创伤后会导致骨髓衰竭，创伤后高炎症反应状态和G-CSF（粒细胞集落刺激因子）浓度升高将导致骨髓干细胞造血功能受损，并容易引发感染。在动物实验中发现通过MSC治疗能逆转骨髓损伤。Gore等人比较了两种小鼠模型来研究同种异体骨髓细胞损伤后的治疗效果，结果发现经过MSC治疗后骨髓细胞计数和功能恢复到正常，同时血浆中的G-CSF 浓度也恢复正常。

严重创伤后经常会合并急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。Hayes等人在呼吸机引起的肺损伤小鼠模型中发现，使用人MSC进行静脉内注射后，小鼠的肺顺应性得到了提高，同时肺实质损伤得到改善，MSC还能减少炎症介质的释放及肺泡内炎症渗出；Maron-Gutierrez 等在研究脂多糖(LPS)诱发的肺损伤小鼠模型中发现，人类MSC除了减少了炎症反应和肺不张外，同时还调节了巨噬细胞的抗炎功能。Wilson等人进行了一项I期临床试验，以确定MSC的安全性，试验在9名中度至重度的ARDS患者中注射同种异体的MSC，结果没有报道相关的副作用，但在随后的II期研究中发现死亡率高达22%，与中度至重度ARDS患者的死亡率相似。

6.干细胞在血管生成中的作用

对于创伤修复来说，恢复良好的血供是治疗的关键。创伤可导致急性和迟发性的毛细血管损伤，包括直接伤害、血管闭塞或因外科手术治疗创伤时所造成的医源性损伤。在受伤后，干细胞对血管生成有直接和间接的影响。一些研究表明，ESC迁移到受伤的部位后直接参与了新生血管的形成。其他的研究也已经证实ESC通过生长因子、细胞因子的调节促进新生血管生成。MSC和ADSC也有促进血管生成的类似作用。这些干细胞的血管生成功能最终有助于改善骨折的愈合、毛细血管再生、伤口的康复及减少炎症并发症。

7.目前干细胞的研究现状及未来的展望

目前，在国外尽管临床试验注册中心进行了大量的1、2和3期临床试验，但仍然缺乏公开的临床试验。关于干细胞治疗在骨折愈合方面的研究，从文献检索中获得的最高水平是2个二级的研究以及大量的动物研究和基础研究。尽管干细胞疗法在通过组织再生和免疫调节治疗创伤后，对改善患者预后有很大的帮助，但目前的文献显示结果还是不一致的。在干细胞治疗临床应用之前，还需要克服许多困难。在动物模型和临床试验中仍需要进一步的研究来描述干细胞在组织修复上的作用机制。此外，这些潜在的治疗方法是否会导致功能改善和副作用也有待观察。

二次整理者： 阮登峰/沈炜亮

浙江大学医学院附属第二医院·骨科；

浙江大学骨科研究所；

浙江大学李达三·叶耀珍再生医学发展基金；

浙江省组织工程与再生医学技术重点实验室；

中国医师协会骨科医师分会再生医学工作组；

本人专业诊治范围：

1，肌腱病&肌腱/韧带损伤：肘-网球肘；肩-肩周炎，肩袖损伤；膝-弹跳膝，跑步者膝，前交叉韧带损伤；踝-跟腱炎，跟腱断裂；手腕部-腱鞘炎；筋膜炎

2，再生医学技术治疗运动系统疑难杂症，包括：软骨/半月板/肌腱/韧带的修复、重建和再生；

门诊类型：肌腱病专科门诊！关节外科/运动医学专家门诊；

致谢：感谢医学界急诊与重症频道 张盛的分享！