【科学前沿】2016年值得关注的新技术！

2016年备受关注的新技术有哪些？“魔剪”CRISPR基因编辑技术、液体活检及冷冻电镜已霸占了整年的各大TOP级期刊。研究人员不断改进CRISPR基因编辑技术，希望在基因组的多个位点实现精确的基因编辑，助力快速的迈向临床。浙江大学医学院附属第二医院骨科沈炜亮

中国学者韩春雨利用NgAgo进行DNA引导的基因组编辑震惊了全世界，然而后续一波又一波的国内外研究人员的争议牵动着无数人的心。另外，中国学者在冷冻电镜方面也取得了了不起的成就，标志着结构生物学进入新时代。

一、基因编辑

CRISPR基因编辑技术依旧是今年生物技术领域的热点。在科研领域，它已展现了巨大的潜力，并帮助科学家们建立了一个个不同的疾病模型，让我们了解特定基因的重要性。CRISPR已经不再局限于基础研究方面的应用，今年有不少研究成果证明CRISPR可以用于临床治疗，比如肺癌，消除某些遗传病，艾滋病的突破等等。

近期来自中国成都市四川大学华西医院的一个研究人员团队首次将利用CRISPR–Cas9进行过基因编辑的细胞注射到一名病人体内。

这项研究是由四川大学华西医院肿瘤学家卢铀教授领导的。它涉及一名已接受注射的病人和9名其他的志愿者。全世界其他的团队，包括美国的一个团队，仍然处于开展类似的临床试验的规划阶段。美国的一项临床试验（计划在明年早期开展）也将研究利用CRISPR编辑的基因抵抗癌症的可能性。一些人已提出中国卢铀团队取得的新进展指示着超级大国之间开始开展竞赛，这令人回忆起二十世纪六十年代美国和苏联之间开展的太空竞赛。

著名科学期刊Cell Reports日前发布了一项新成果，科学家利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，在人体免疫T细胞内对45个与HIV入侵宿主相关的基因进行特殊编辑分析，甄别出了其中某些基因经编辑改造发生突变后，可保护T细胞免受HIV病毒的侵入、整合、转染。这对于彻底清除HIV病毒、预防和治愈艾滋病有重要意义。

科研人员构建了特殊的CRISPR/Cas9基因组编辑系统，并将其输入T细胞内来完成标靶基因编辑工作。他们在来自健康志愿者的成千上万个T细胞样本中，前后共进行了149次特殊的CRISPR/Cas9基因组编辑操作。每次编辑之后，他们分析编辑后获得特定突变的T细胞能否抵御HIV感染。他们最终发现了数个基因经编辑发生突变后，可使得T细胞完全或部分抵御HIV病毒感染，这类保护性特定突变基因包括CXCR4,CCR5,LEDGF和NUP153。

7月《自然》杂志曾报道成都的四川大学华西医院有望率先将CRISPR基因编辑技术应用到人体。今日，《自然》杂志进行了后续报道，并确认全球首个CRISPR技术的人体应用已在中国启动。

这项临床试验的招募对象是患有非小细胞肺癌，且癌症已经发生扩散，化疗、放疗及其他治疗手段均已无效的患者。按计划，卢铀教授的团队从招募的患者体内分离出T细胞，并利用CRISPR技术对这些细胞进行基因编辑，敲除这些细胞中抑制免疫功能的PD-1基因，并在体外进行细胞扩增。当细胞达到一定量后，卢铀教授的团队将它们输回患者体内，并希望它们能对肿瘤进行杀伤。

二、液体活检

如果医生想深入了解肿瘤，他们的选择往往很有限。现有的技术都不太理想，液体活检技术的出现，解决了很多有关肿瘤的问题，也提前了癌症的诊断时间。这也是液体活检技术被《麻省理工大学科技评论》评选为“2015年十大突破技术”的原因。作为体外诊断的一个分支，液体活检就是通过血液或者尿液等对癌症等疾病做出诊断。其优势在于能通过非侵入性取样降低活检的危害，而且有效延长患者生存期，性价比高。

如今，液体活检的主要检测物包括检测血液中游离的循环肿瘤细胞（CTCs），循环肿瘤DNA（ctDNA）碎片，循环RNA（Circulating RNA）和外泌体（携带有细胞来源相关的多种蛋白质，脂类，DNA，RNA等）。其中，ctDNA，RNA和外泌体是肿瘤细胞自身分泌或死亡时释放的物质。

在液体活检方面，今年也是硕果累累。

在2016年的美国科学进展协会（AAAS）年会上，加利福尼亚大学牙科学院的David T.W.Wong医生、Felix教授和研究副主任Mildred Yip教授，讨论了一种新设备的原型，名为电场诱导的释放和测量装置（EFIRM），这种装置可以检测唾液中的非小细胞肺癌（NSCLC）的生物标志物。

常规评估程序的临床试验将于今年中期在中国和台湾先后开展。“与西方相比，亚洲的肺癌的发生率和驱动基因EGFR的突变率高出3倍。”Wong医生解释道，“这项技术是全球的，所以我们计划在世界其它地区也慢慢开展常规评估，特别是亚洲的临床试验成功后，预计2017年早期能出结果。”

近日，来自加拿大多伦多大学的研究人员利用非侵入性液体活检方法发现了前列腺癌生物标记物，能够在手术前帮助鉴定侵袭性前列腺癌。该研究发表在国际学术期刊Nature Communication上，研究人员认为对于许多男性来说生长缓慢低风险的前列腺癌可能永远都不需要进行手术治疗，而目前全世界存在许多过度治疗问题，该研究将推动精确的非侵入性诊断工具的开发。

目前临床上主要使用穿刺活检帮助进行前列腺癌诊断，但是这种技术可能无法检测到隐藏肿瘤或者已经扩散的肿瘤。而液体活检是一种理想的诊断方法，有助于区分哪些病人适合进行强化治疗，而哪些病人不需要。

发表在Cell上的一篇报道中，华盛顿大学的科学家就表示他们开发了一种新方法可以克服当前液体活检技术的局限性，从而就以帮助鉴别出哪些类型的细胞可以产生游离DNA；这种方法可以扩大液体活检的检测范围，其依赖于对个体机体中游离DNA的片段谱系进行分析，同时将这种谱系信息同细胞多种死亡生理条件进行对比。

研究者Shendure说道，我们的研究表明，通过观察游离DNA的片段谱或许就可以帮助鉴别出产生游离DNA的特殊组织，而这种方法替代了直接寻找DNA特殊突变的方法；新型检测技术可以对每个DNA片段的末端进行检测，并且找到DNA的热点区域；为了“装入”细胞核，DNA就必须进行卷曲，不断折叠形成紧密的包裹形式，而该过程的关键就是名为核小体的结构，核小体是由DNA和组蛋白组成的染色质基本结构单位，其在整个基因组中以串联形式排列，就好像细绳上的珠子一样，机体中的每个细胞都会以不同方式将DNA紧密压缩，而这些差异性就给每个细胞游离DNA带上了一定的标记。

大多数的液体活检技术都会寻找机体中不同细胞间的特殊DNA错配，比如存在于肿瘤细胞但不存在于健康细胞的突变等，研究者认为这种新型检测技术的优势就在于其甚至可以对遗传特性相当的两个细胞进行有效区分；目前这种新技术可以对液体活检不能诊断的一系列疾病进行检测，而研究者希望新型检测技术可帮助进行诸如心脏疾病、中风及自身免疫等疾病的诊断。

三、冷冻电镜

冷冻电镜技术为结构生物学领域带来了一场革命，催生了大量的研究新成果，更令人高兴的是中国学者多次在顶级期刊上发表重要成果，将中国原创研究推向世界。

近期来自清华大学生科院的施一公院士在SCIENCE杂志发表题为“Biological cryo-electron microscopy in China”的综述，文章回顾了冷冻电镜在中国的发展历史，描述了目前的使用情况，讨论了这一技术对生物学研究带来的影响，并展望了它的前景。

文章表示，冷冻电子显微镜（cryo-EM）在结构生物学的发展中越来越重要。在2008-2016年，中国内地科研人员发表的多项代表性成果，共计53篇，解析了冷冻电镜在染色质组织、免疫反应、离子通道、光合作用、核糖体生物起源、RNA代谢和病毒结构等研究中的应用。在结论部分，作者表示，尽管冷冻电镜在其它国家也在快速、健康的发展，但是中国的增长速度远超过世界平均水平；并且，这一趋势预计会再持续5-10年。

那么接下来让我们感受一下我国科研学者所取得的重大研究成果。

清华大学颜宁课题组与中国疾控中心、中科院微生物组高福院士课题组合作的一项最新成果，在世界上首次解析出NPC1蛋白的清晰结构，并初步揭示了它的工作过程，从而为干预、治疗罕见遗传疾病“尼曼—皮克病”和埃博拉病毒打开了新大门。

颜宁教授过去9年一直针对胆固醇代谢调控通路进行系统的结构生物学与生物化学研究，高福院士一直从事包括埃博拉病毒在内的重大传染疾病相关病毒入侵机制的结构生物学研究。他们合作的研究论文《NPC1蛋白介导胆固醇转运和埃博拉病毒入侵的分子机制》，发表在5月26日的《细胞》杂志上。该论文在国际学术界首次报道了人源胆固醇转运蛋白NPC1的4.4埃分辨率冷冻电镜结构，并分析探讨了NPC1和NPC2两个蛋白协作介导细胞内胆固醇转运的分子机制，同时为理解NPC1介导埃博拉病毒入侵的分子机制提供了分子基础。

8月31日，国际著名期刊《Nature》在线刊登了清华大学、北京生命科学研究所的一项重要成果。这项研究在3.6 Å的标称分辨率上，解析了兔Cav1.1复合物的冷冻电子显微镜结构。

在这项研究中，研究人员在3.6 Å的标称分辨率上，解析了兔Cav1.1复合物的冷冻电子显微镜结构。离子导电α1亚基的内闸门是关闭的，所有四个电压传感结构域都采用一个“向上”的构造，这意味着一个潜在失活的状态。孔结构域延长的胞外环，是由多个二硫键稳定的，在选择性过滤器上面形成一个窗口化的圆顶。圆顶的一面为α2δ-1-亚基提供停靠的站点，而另一面则可能通过其表面负电位吸引阳离子。

细胞内I–II和III–IV连接器螺旋分别与β1a亚基和α1的羧基末端结构域相互作用。粒子的分类产生了两个额外的重建，显示β1A的显著位移和α1的相邻元素。CaV1.1复合物的原子模型，为兴奋-收缩偶联的机制理解，奠定了基础，并为Cav和Nav通道的功能和疾病机制的分子解释，提供了一个三维的模板。

2016年5月25日，清华大学高宁研究组与合作者在《自然》（Nature）杂志在线发表了题为细胞核内的核糖体组装前体结构揭示了装配熟因子的功能多样性（Diverse roles of assembly factors revealed by structures of late nuclear pre-60S particles）的研究论文，报道了位于酵母细胞核内的一系列组成上和结构上不同的核糖体60S亚基前体复合物的冷冻电镜结构，确定了近20种装配因子在核糖体上的结合位置及其原子结构。本论文所含有的丰富的结构信息为详细分析真核核糖体装配过程中的多种装配因子的功能和分子机制提供了基础。

9月22日，颜宁研究组与加拿大卡尔加里大学陈穗荣研究组合作在Science杂志上在线发表标题为“Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodinereceptor RyR2”的研究长文，揭示了目前已知分子量最大的离子通道Ryanodine受体RyR2亚型处于关闭和开放两种状态的三维电镜结构，探讨了RyR2的门控机制。

二次整理者：阮登峰/沈炜亮

浙江大学医学院附属第二医院·骨科；

浙江大学骨科研究所；

浙江大学李达三·叶耀珍再生医学发展基金；

浙江省组织工程与再生医学技术重点实验室；

中国医师协会骨科医师分会再生医学工作组；

本人专业诊治范围：

1，肌腱病&肌腱/韧带损伤：肘-网球肘；肩-肩周炎，肩袖损伤；膝-弹跳膝，跑步者膝，前交叉韧带损伤；踝-跟腱炎，跟腱断裂；手腕部-腱鞘炎；筋膜炎

2，再生医学技术治疗运动系统疑难杂症，包括：软骨/半月板/肌腱/韧带的修复、重建和再生；

门诊类型：肌腱病专科门诊！关节外科/运动医学专家门诊！

致谢：文章来源：2016-12-06 MedSci研究